一、條件性基因敲除實(shí)驗(yàn)原理與核心系統(tǒng)

1. Cre-loxP系統(tǒng)

• 組織特異性：將Cre基因連接至特定啟動(dòng)子（如心肌細(xì)胞αMyHC啟動(dòng)子），實(shí)現(xiàn)靶向器官敲除。

• 時(shí)間誘導(dǎo)：

• CreERT系統(tǒng)：Cre與突變雌激素受體（ERT）融合，注射他mo昔芬（Tamoxifen）后激活重組功能。

• Tet-on/off系統(tǒng)：通過強(qiáng)li霉素（DOX）調(diào)控rtTA轉(zhuǎn)錄因子，控制Cre表達(dá)。

• 起源與機(jī)制：源自P1噬菌體，由Cre重組酶和34bp的loxP位點(diǎn)組成。Cre酶識別loxP方向并介導(dǎo)DNA重組，根據(jù)loxP排列實(shí)現(xiàn)基因刪除、反轉(zhuǎn)或易位。

• 時(shí)空特異性控制：

2. 替代重組系統(tǒng)

• Flp-FRT/Dre-Rox系統(tǒng)：作用類似Cre-loxP，但重組效率較低，應(yīng)用較少。

二、條件性基因敲除小鼠的構(gòu)建流程

1. 基礎(chǔ)步驟：

• Step 1：構(gòu)建"Flox小鼠"——在目標(biāo)基因關(guān)鍵外顯子兩側(cè)插入同向loxP序列。

• Step 2：選擇表達(dá)Cre的工具鼠（組織特異性或誘導(dǎo)型）。

• Step 3：雜交繁育，獲得Flox/Cre雙陽性小鼠，Cre表達(dá)時(shí)靶基因被切除。

2. 誘導(dǎo)方法示例：

• Tamoxifen誘導(dǎo)：75–100 mg/kg腹腔注射，連續(xù)5天（溶解于玉米油或葵花籽油）。

• DOX誘導(dǎo)：通過飲水或飼料給予強(qiáng)li霉素，激活Tet系統(tǒng)。

三、條件性基因敲除實(shí)驗(yàn)核心應(yīng)用場景

1. 解決傳統(tǒng)敲除局限性：

• 避免胚胎致死（如抑癌基因PTEN全身敲除致胚胎死亡）。

• 研究基因在特定發(fā)育階段或組織中的功能（如神經(jīng)元、腸道上皮）。

2. 疾病機(jī)制研究：

• 腎病模型：髓系特異性核因子ⅠB敲除揭示腸道炎癥機(jī)制。

• 腫瘤學(xué)：Pten條件敲除小鼠模擬前列腺癌、膠質(zhì)瘤等發(fā)病過程。

• 神經(jīng)科學(xué)：PDGFB基因在Tamoxifen誘導(dǎo)后影響皮質(zhì)神經(jīng)元功能。

3. 藥物研發(fā)：

• 他mo昔芬對腸道菌群的影響評估。

• 靶向基因編輯驗(yàn)證抗癌藥物敏感性。